Vitajte na [www.pocitac.win] Obľúbené stránky
Keď boli mikroskopy vynájdené okolo 1600 ° C, prírodní filozofi obrátili svoje oči na svet vo svete. Keď Antony van Leeuwenhoek vytvoril malé, vysoko zakrivené šošovky a mechanický držiak na prispôsobenie pohľadu, otvoril okno do mikroskopického sveta baktérií, krviniek, prvokov a bunkovej štruktúry rastlín. Ale v histórii mikroskopie bola vždy jedna otázka: Aké sú tieto podivné veci viditeľné cez šošovku? Fluorescenčná mikroskopia sa týka súboru techník, ktoré minimalizujú túto neistotu - pretože vo fluorescenčnej mikroskopii, keď na vzorke svieti svetlo, svieti svoje vlastné svetlo späť.
Epifluorescencia
Zďaleka najbežnejším fluorescenčným mikroskopom je konfigurácia epifluorescencie. V epifluorescenčnom mikroskope svetelný zdroj - zvyčajne ortuťová alebo xenónová lampa - svieti cez filter, ktorý vyberá úzku oblasť vlnových dĺžok. Filtrované svetlo svieti na vzorku cez objektív mikroskopu. Prichádzajúce svetlo je absorbované fluoroformi - molekulárnymi značkami, ktoré emitujú svetlo s dlhou vlnovou dĺžkou, keď absorbujú svetlo s kratšou vlnovou dĺžkou. Svetlo z fluoroforov spolu s rozptýleným svetlom zo zdroja osvetlenia sa vracia späť do objektívu a do detektora alebo oka. Po ceste ďalší filter blokuje osvetľovacie svetlo, takže zostáva iba fluoreskujúce svetlo zo vzorky.
Konfokálny
Epifluorescenčný mikroskop zhromažďuje svetlo zo všetkých hľadísk v zornom poli mikroskopu. , Časť excitačného svetla je absorbovaná pred ohniskovou rovinou mikroskopu, iná v ohniskovej rovine a iná za ohniskovou rovinou. Pretože mikroskop zhromažďuje všetko toto svetlo, obraz bude obsahovať ostrý obraz svetla pri zaostrení, ale bude mať tiež zaostrené svetlo z iných oblastí. Konfokálny mikroskop opraví, že zaostrením laserového bodu v rovnakej rovine ako je zaostrený mikroskop. Potom sa pred detektor nachádza diera, kde blokuje všetko svetlo, ktoré nepochádza z mikroskopu. Naskenovaním vzorky je možné získať čistý trojrozmerný obraz objektu.
Multiphoton
V konfokálnom mikroskope je zarovnanie veľmi citlivé. Ak je laserová škvrna, objektív mikroskopu, zberná optika a diera vypnuté, aj pri najmenšom množstve, ktoré výkon mikroskopu trpí. Multifónový mikroskop obchádza tento problém pomocou laserovej vlnovej dĺžky, ktorá je iba o polovicu taká energetická, ako je potrebné, aby excitovala fluorofory vo vzorke. Jediný spôsob, ako sa fluorofory nadchnú a emitujú fluorescenciu, je, ak je laserové svetlo dostatočne jasné, aby dve častice svetla - fotóny - zasiahli fluorofor vo veľmi krátkom čase. To sa deje iba vtedy, keď je laser zameraný na veľmi malé miesto. Jediné miesto vo vzorke, ktoré bude vyžarovať svetlo, je miesto, kde je zaostrený laser, čo udržuje pekný a čistý obraz, pretože neexistuje žiadne ďalšie pozadie, ktoré by sa mohlo zbaviť - čo znamená, že sa nevyrovná žiadna diera.
Celková interná reflexná fluorescencia (TIRF)
Ďalším spôsobom, ako získať veľmi čisté obrázky, je zabezpečiť, aby sa excitačné svetlo nedostalo príliš ďaleko do vzorky. Ak je napríklad kvapka neurónov umiestnená v kvapke roztoku na sklenené podložné sklíčko, niektoré z neurónov priľnú na sklenený povrch. V fluorescenčnom mikroskope s úplným vnútorným odrazom (TIRF) je svetlo nasmerované nabok do skleneného podložného sklíčka, takže sa v skutočnosti nedostane do roztoku obsahujúceho bunky. Ale niektoré svetlo len málo presakuje do roztoku - len veľmi blízko k povrchu skla. To znamená, že jediné miesta, ktoré budú vyžarovať svetlo, budú vo veľmi tenkej oblasti priamo oproti sklenenému povrchu. Pre niečo ako neuróny, kde sa na povrchu buniek deje toľko zaujímavých vecí, môže byť táto technika veľmi účinná.
Super-rozlíšenie
Všetky mikroskopy - vrátane fluorescenčných mikroskopov - sú obmedzené fyzika, ktorá riadi šírenie svetla. Jedným zo základných pravidiel je to, že sústredené miesto svetla sa môže zmenšiť - a nie menšie. Pri viditeľnom svetle je táto veľkosť asi 200 nanometrov alebo 200 miliárd metrov metra. Jednotlivé molekuly majú veľkosť iba niekoľko nanometrov, takže existuje veľa zaujímavých funkcií, ktoré sú pod týmto limitom veľkosti, nazývané difrakčný limit. Vedci vyvíjajú techniky „super-rozlíšenia“, aby sa prekĺzali okolo tohto limitu. Napríklad štruktúrovaná iluminačná mikroskopia (SIM) a mikroskopia so stimulovanou depléciou emisií (STED) sú napríklad fluorescenčné mikroskopické metódy, ktoré obmedzujú veľkosť svetelného bodu zmenšovaním veľkosti excitačného svetelného bodu.
Copyright © počítačové znalosti Všetky práva vyhradené